【问题1】大肠杆菌能生产糖蛋白吗？
【解答】干扰素有两种类型,一种是天然干扰素；另一种是重组干扰素,是通过基因工程技术生产的。研究表明，以基因工程和发酵工程为手段,用大肠杆菌生产出来的干扰素是没有糖链的,化学本质虽不是糖蛋白,但同样能够抑制病毒在细胞内的增殖,增强T、B淋巴细胞的功能,加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用,也是干扰素。
真核细胞给蛋白加上糖链后,能够帮助蛋白折叠成正确的构像, 同时糖链有助于蛋白质的溶解,防止蛋白聚集沉淀,从而能使糖蛋白分泌到细胞外。而在大肠杆菌表达的非糖基化蛋白常常会聚集成不溶性的包涵体。一方面,包涵体中的蛋白是没有生物活性的,需要通过后续的溶解、纯化、复性等使其变成有生物活性的蛋白[1]；另一方面,一些糖蛋白在去除糖链后尽管仍具有一定的生物活性,但是易被蛋白酶降解。因此,真核细胞表达的干扰素需要糖链来稳定结构、帮助溶解, 并通过转运系统分泌到细胞外,以达到抗病毒、抗肿瘤的功效。
目前科学家发现某细菌里存在生产糖蛋白的基因簇,科学家用基因工程方法将这套基因簇克隆至大肠杆菌内进行表达,使得大肠杆菌也能够生产出相应的糖蛋白[2]。
【主要参考文献】
[1]夏启玉,肖苏生等,邓柳红.2008.包涵体蛋白的复性研究进展[J].安徽农业科学, 36 ( 14) :5801～5803
[2]王宏华, 凌红丽.2008.乳糖诱导重组鸡γ干扰素基因在大肠杆菌中的表达[J].中国动物检疫, 25( 6) :25 ～ 27
【问题2】蛋白质的分离纯化有哪些方法？
【解答】蛋白质的分离方法除了教材介绍的凝胶色谱法之外，还有以下几种方法：
1、粗提取方法有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法[1]；
2、离心法有差速离心法、密度梯度离心法[1]；
3、精提取方法有离子交换层析、疏水相互作用层析、置换层析、亲和层析、高效液相色谱、聚丙烯酞胺电泳、等电聚焦电泳[2]、毛细管电泳；
4、此外，还有双水相萃取技术、浊点萃取法、反胶团萃取等方法[1]。
迄今为止，我国还没有研究单一的蛋白质分离方式，不能利用合理的措施提升其纯度与分离效果。还需要利用物理与化学方式对其分离处理，在多种方法联合的情况下，确保蛋白质的分离纯化符合规定。
【主要参考文献】
[1]张向阳主编. 医学分子生物学[M]. 南京，江苏凤凰科学技术出版社, 2018.02：272-274.
[2]Hey J，Posch A，Cohen A，et al.Fraction of complex protein mixtures by liquid－phase isoelectric focusing［J］.Methods in Molecular Biology，2008，424:225－239.
【问题3】动物细胞培养的代数是细胞分裂次数吗
【解答】原代培养是指从机体组织分离后立即在体外进行首次培养，使其在合适的条件下增殖到第一次传代阶段的培养阶段。这样培养的细胞称为原代细胞。原代细胞与机体组织在形态结构和功能上很相似，细胞移动活跃，细胞分裂不旺盛[1]。
传代培养是指当培养容器内培养的体外动物细胞增殖达到一定密度后，因为生存空间和营养有限，细胞会停止分裂增殖，这时需要分离到多个容器中继续培养，使细胞继续生存增殖，进行一次分离再培养称之为传一代，这样培养的细胞称为传代细胞[2]。
综上所述，动物细胞培养的代数是指分瓶的次数，而不是分裂次数。
【主要参考文献】
[1]金征宇[等]主编. 基因与纳米探针医学分子成像理论与实践[M]. 天津科学技术出版社, 2017: 807.
[2]刘斌. 细胞培养[M]. 北京/西安:世界图书出版公司, 2018.01: 62.
【问题4】高压蒸汽灭菌前为什么要将锅内冷空气排尽？
【解答】高压蒸汽灭菌锅内蒸汽的温度不仅与压力有关，而且与蒸汽的饱和度有关。灭菌锅内冷空气未排尽时，即使蒸汽压力达到要求，气压针所指的压强不是饱和蒸汽产生的压强。相同的压强，混有空气的蒸汽其温度低于饱和蒸汽所产生的温度，温度上不到相应的高度[1]，而且还影响高压蒸汽穿透被灭菌物品的能力，因此完全排除锅内空气使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。故首先要打开进气阀门，引导外源蒸汽进人夹层，冷空气与冷凝水由夹层的阻气器排出，大约需要10min后，再打开进气阀，蒸汽即进入锅内，如此充分的时间即可排除冷空气。如何判断冷空气是否排尽，可观察排气口的气体，若排气口气体呈白色雾状；或在排气口出口处连接一橡皮管，将另一端插入冷水盆中，若管内排出气体在冷水中产生气泡，表示锅内空气尚未排尽，需要继续排气。若不产生气泡，表示锅内空气已基本排尽。当压力表显示锅内达到所需温度时，应尽量关小排气阀以防蒸汽损失，造成锅内缺水，但注意关闭不能太紧，应稍有气体排出，保持温度压力相匹配[2]。
【主要参考文献】
[1]许晓风主编；周学，袁学智，夏文静，张亮，吴金龙，姜海建副主编. 大学实验室基础训练教程[M]. 南京：东南大学出版社, 2018.06:78.
[2]王芳，李滨，郭恒俊，郭兴启.高压蒸汽灭菌锅的使用[J].实验室科学,2008,(6):155.
【问题5】何为基因融合技术
【解答】人教版选择性必修3第92页，对基因融合技术只介绍一句话，那么该技术具体怎样融合基因，获得的蛋白质活性怎样，具有哪些实际意义呢？
基因融合技术是将不同的基因连接起来从而表达具有复合功能的融合蛋白，构建融合蛋白的基本原则是：将第一个蛋白基因的终止子删除，再接上带有终止子的第二个蛋白基因，即可实现2个基因的融合表达[1]。融合蛋白除了具有衍生因子的双重活性外，其各自的活性可能发生如下变化。
（1）一些融合蛋白的活性较各自野生型低；
（2）活性与野生型因子活性的相加作用一致；
（3）融合蛋白的活性高于衍生因子的相加活性；
（4）人工构建的新蛋白可能具有与衍生因子无关的新活性。
构建融合蛋白技术具有以下实际意义：
（1）有利于回收目的蛋白质；（2）产生新的多功能蛋白；（3）利于检查和产物定位；（4）避免产物的快速溶解；（5）外源蛋白定位在宿主的不同区段；（6）融合蛋白在体外切割提高产量稳定性；（7）研究蛋白质结构[2]。
【主要参考文献】
[1]张德华.蛋白质与酶工程[M]. 合肥：合肥工业大学出版社. 2015：68
[2]刘岩等.基因融合技术及其应用[J].农业生物技术学报.2006,02:273-278
【问题6】基因的定点突变技术是怎样操作的
【解答】一般来说，基因突变是不定向的，是随机的，且突变频率非常低。而通过定点突变技术，可以对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。目前常用的基因定点突变技术有三种：
1、寡核苷酸介导的定点突变
该方法以 M13 噬菌体的单链环状DNA 为载体。首先将目的基因插入到 M13 噬菌体的正链 DNA 上，制备含有目的基因的单链 DNA。再使用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子复制，这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA的一部分，将其转入细胞后，经过不断复制，可获得突变的 DNA 分子( 如下图) ，再经表达即可获得改造后的蛋白质[1]。
2、盒式定点突变
该方法是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当其退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端。由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体( 如下图) [1]。
3、PCＲ 介导的定点突变
PCＲ 介导的定点突变一般需要 4 种引物，进行 3 次 PCＲ 反应。前两次 PCＲ 反应扩增形成两条双链 DNA 片段，这两条双链 DNA 片段经过变性和退火形成具有3’凹末端的异源双链分子，在 Taq 酶的作用下，产生含有重叠序列的双链 DNA 分子，再用两个外侧引物进行第三次 PCＲ 扩增，便产生突变体DNA，然后再构建表达载体进行表达[2]。
【主要参考文献】
[1]Zoller MJ，Smith M． 1982． Oligonucleotide － directed mutagenesis u-sing M13 － derived vectors: an efficinet and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA． Nucleic Acids Ｒeserch，10( 20) : 6487 ～ 6500
[2]张浩．2000．定点突变技术的研究进展．免疫学杂志，2000（4）:108～110
【问题7】聚乙二醇为什么能促使植物原生质体及动物细胞融合？
【解答】聚乙二醇（PEG）是一种用于细胞融合中的优良化学促融剂。它具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体以及动物细胞的融合。具体原因如下：
一、聚乙二醇分子能改变各类细胞的生物膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合，从而形成杂种细胞[1]；
二、聚乙二醇的水溶性强，在液相介质中，其分子表面的醚键带有微弱的负电荷，在Ca2+离子的参与下，可将带正电的表面蛋白或带负电荷的糖蛋白通过Ca2+桥相连，从而使细胞发生聚集、融合。在50%PEG中自由水消失，可导致细胞脱水而引起质膜结构变化和细胞融合。
PEG用于细胞融合中的优点为：通用性强，可用于动、植物和微生物各种细胞；比仙台病毒等易制备和控制；活性稳定，使用方便[2]。
【主要参考文献】
[1]蒋雪薇,王军,朱双,孙英杰,朱晓芹,刘江东.斑马鱼胚胎细胞和中国仓鼠卵巢细胞远缘杂交融合条件的优化[J].氨基酸和生物资源,2016,(第3期).
[2]郭伟.聚乙二醇水溶液性质及小分子的影响[D]. 贵阳：贵州大学,2018.
【问题8】柠檬酸钠的抗凝机制是什么？
【解答】血液凝固分为三个主要阶段：第一，凝血酶原激活物形成；第二，凝血酶原激活物催化凝血酶原转变为凝血酶；第三，凝血酶催化纤维蛋白原转变为纤维蛋白。这三个阶段中，都需要钙离子的参与，所以为防止血液凝固，必须除去钙离子。而柠檬酸钠中的柠檬酸根离子能和钙离子结合，可以形成比较难解离的可溶性络合物，使血液中的钙离子减少，缓解钙离子促进血液凝固的目的[1]。
【主要参考文献】
[1]封飞虎，王松主编. 运动解剖生理学[M}. 武汉：华中科技大学出版社, 2018.03:104
【问题9】培养乳酸杆菌为什么要添加维生素？
【解答】维生素是参与生物生长发育和代谢所必需的一类微量有机物质，在物质的代谢中有重要作用。
首先，由于乳酸杆菌缺乏一些生物代谢途径，不能合成生长必需的氨基酸、维生素等物质，营养要求十分苛刻，必需依赖生长环境提供必需氨基酸、维生素等生长因子才能获得高密度生长；
其次，乳酸菌的蛋白分解能力很弱，必需依赖生长环境提供必需氨基酸、维生素等生长因子才能获得高密度细胞培养[1]；
另外，在培养基中添加维生素，能促进乳酸杆菌生长，降低菌体的死亡率；在菌体生长、细胞活性、产酸，以及乳酸生物合成中需要乳酸脱氢酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶，维生素能提高这些酶的活性，至少提高50%以上；能促进糖代谢途径中与乳酸合成相关途径的通量，使乳酸产量提高40%以上[2]。
【主要参考文献】
[1]白凤翎， 张柏林， 赵宏飞. 大豆蛋白水解物促酸奶乳酸菌增殖及生长动力学[J]. 食品与发酵工业,2012,1:51-56.
[2]邱伙琴，徐国谦，庄英萍，储炬，张嗣良. 维生素对乳酸菌细胞活性和代谢途径相关酶活性的影响[J]. 华东理工大学学报,2007,33(3):330-335.
【问题10】平板划线的操作只有一种方法吗？
【解答】平板划线法在实际的操作中分为两种：交叉划线法和连续划线法。
交叉划线法适用于含菌量多或含有不同细菌的培养物。操作方法见人教版选修一教材第18页；连续划线法适用于细菌数不太多的培养物，用接种环先沾取培养物，涂布于平板表面一角，然后连续作紧密的波浪式划线，直至平板中央。转动培养皿180，再从平板另一边（不烧接种环）同样划至平板中央后培养，实质上属于一种“由点到线”的划法[1]。教材第14页的右图即可认为是运用的这种方法。
【主要参考文献】
[1]洪坚平，谢英荷等编著.农业微生物资源的开发与利用[M].北京：中国林业出版社, 2000.08:43.
【问题11】乳酸杆菌必须无氧培养么？
【解答】厌氧菌通常是指一类只能在低氧分压的条件下生长，而不能在空气（18%氧气）和（或）10％二氧化碳浓度下的固体培养基表面生长的细菌。
大多数乳酸杆菌属于耐氧性厌氧菌。分子氧对它们无害，无论在有氧或无氧条件下都生长良好，好氧生长速率甚至可能高于厌氧生长速率；其产物有乳酸、乙酸和少量丙酮[1]。 在制作泡菜和酸菜的过程中就是利用乳酸菌的这一生理特点。由于乳酸杆菌生长旺盛产生大量乳酸，使环境的pH下降，从而抑制不耐酸的腐败细菌的生长。而乳酸杆菌具有高度耐酸性，它的生长不受酸抑制。在制作过程中需要密封，隔绝空气。这并不是为乳酸杆菌创造无氧的生长条件，而是为了抑制好氧腐败细菌的生长[2]。
【主要参考文献】
[1]Elisabeth Borch and GÖran Molin.The aerobic growth and product formation of Lactobacillus,Leuconostoc,Brochothrix, and Carnobacterium in batch cultures[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 1989,(30):81-88.
[2]颜方贵.发酵微生物学[M].北京:中国农业大学出版社,1993,01:134-135
【问题12】什么是磁力搅拌器？
【解答】人教版选修一的血红蛋白的提取和分离实验中，将红细胞中血红蛋白释放出来，需要用磁力搅拌器充分搅拌10min，那么什么是磁力搅拌器呢？
磁力搅拌器是用于液体混合的实验室仪器（如下图），主要用于搅拌或同时加热搅拌低粘稠度的液体或固液混合物，无振动、搅拌效果显著。和摇床一样，可以免除长时期的手工机械操作[1]。
其基本原理是利用磁场的同性相斥、异性相吸的原理，利用磁场推动放置在容器中带磁性的搅拌子进行圆周运转，从而达到搅拌液体的目的。一般的磁力搅拌器具有搅拌和加热两个作用。搅拌使反应物混合均匀，使温度均匀；加热是在一个密闭的容器中进行，配合加热温度控制系统，可以根据具体的实验要求加热并控制样本温度，维持实验条件所需的温度条件，保证液体混合达到实验需求，以加快反应速度或者蒸发速度[2]。
【主要参考文献】
[1]衷友泉，万屏南主编；杨婕，林艳，程林等副主编. 中医药基础化学实验 第3版. 北京：中国协和医科大学出版社, 2017.07:89-90.