上回说到单细胞测序携手原位检测可以解决细胞的三大终极问题，说归说笑归笑，到底能不能还得实际干了说的算。
当我在漫天文章中寻找应用案例时，还在担心找不到合适的栗子，搜集了一波之后这个担心直接就被打破了，而另一个担心随之而来，因为只近几年使用单细胞测序加原位检测的文章就铺天盖地的了，这么多案例应该用哪一个啊？
目前单细胞测序联合原位检测可以有很多探索以及验证方面的作用，每篇文章使用的意义也不尽相同，甚至没有太多的意义也要做个原位检测看一看测出来的基因搁哪呢，有种测完单细胞之后不做个原位检测就不完整的感觉，生怕测出来的单细胞不看一眼它在哪里就会跑了一样，原位检测一下就很踏实。
案例浏览若干，文献三千只瓢了三篇。刚好以2018年发表的三篇CNS级别的文章来小小的探究一下单细胞测序联合原位检测的魅力（其实是选了好久才定了这同一年的三篇CNS，为了科学的艺术性之一——强迫症）。虽然这几篇都是几年之前发表的，但其意义代表性仍经典不衰。下面就以这三个代表分别展示单细胞测序联合原位检测的魅力，排名不分前后（就是根据C-N-S的顺序）。
（在此仅关注单细胞测序与原位检测联合使用的意义，不对所引文章的其他内容进行解读。）
魅力一：特定细胞类型的空间定位
代表选手：【2018-Cell】Molecular Architecture of the Mouse Nervous System
这篇文章主要是关注小鼠神经系统的分子构筑情况，所谓分子构筑（Molecular Architecture这个更严谨）就是分子的建筑结构，那就需要知道分子的种类和位置信息，即“我是谁”和“我在哪”的问题。
本文首先对小鼠的神经系统（中枢和外周）进行了大量的单细胞测序工作，共获得了50多万个单细胞数据，并从高质量的细胞中聚类出了265个细胞类群，包括神经元大类以及非神经元大类，基本上涵盖了神经系统所涉及的所有细胞类型。
其次，本文对其中的星形胶质细胞（Astrocyte）进行了进一步的分析和分类，主要通过单细胞测序数据中差异表达的特征基因（Marker）进行不同类型的星型胶质细胞细化。在神经系统中，胶质细胞扮演的角色不可或缺，可这些细胞在空间上分布以及与神经元的交互是怎样的还没有完全清楚。
于是本文根据前期分析得出的Marker基因（组合）对主要几种星型细胞做了一个全脑范围（矢状面）的空间定位，发现不同的星型细胞在空间位置上是有着严格的分布特征的（F），为后续揭示整个神经系统的构架图谱提供了看得见的基础。
所谓结构决定功能。只不过在这里这个结构主要指的是细胞的分子类型和空间位置。通过单细胞测序分析细胞类型，然后根据特征基因通过原位检测实现对这些细胞类型的空间定位，这个意义也是目前两种技术联合应用最多的方面了，算是黄金搭档，高分标配了。
魅力二：确认新的细胞类型
代表选手：【2018-Nature】A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes
单细胞测序技术在一定程度上打破了我们传统对细胞类型的认知与划分，使得每个细胞都有属于自己的分子特征，也逐渐的让我们发现了一些新的细胞类型。但是仅仅通过单细胞测序来发现新的细胞类型往往不太靠谱，因为在这个技术操作过程中，双细胞、胞外游离RNA干扰以及聚类参数的不同都有可能导致出现新的类群划分，而这群细胞究竟是不是新的细胞类型，还需要其他方面的证据。且看这位选手是如何展现他的独特魅力的。
本文首先对小鼠的气道组织进行了单细胞测序，聚类之后发现了一个特别的类群（b中所圈），细胞占比很少而且其分子谱特征与目前已知的显著不同，并根据其独特的表达特征将其命名为“肺部离子细胞（pulmonary ionocyte）”。
更具有重要意义的是这类群所特有高表达的CFTR基因和囊性纤维化相关，而这群细胞是否真的存在以及存在哪就变得十分重要了。于是本文就利用这个类群表达的特征基因FOXI1和CFTR进行了原位检测，通过最直接的方式验证了这类新型细胞的存在以及分布的位置，并做了一系列的验证和功能探索。
所谓所见即所得。单细胞测序是离体的，原位检测是在体的，二者联手，序列位置全都有。
魅力三：更实用更精细的空间转录组图谱
代表选手：【2018-Science】Molecular, spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region
只看这位选手的名字，就可以将我们所说的单细胞测序联合原位检测的魅力展现地淋漓尽致，Molecular（我是谁）- Spatial（我在哪）- Functional（我要干嘛），精准而优雅。
大脑作为高级动物最神秘的器官，其中细胞多种多样且以独特的方式进行组装和联系，从而可以行使控制和调节机体行为的高级功能。对其在单细胞层次上分子、位置、功能等方面的解析尤为重要。
于是本文针对下丘脑区域进行了一系列的单细胞测序，得到了一百万左右的单细胞数据，分析了在此区域存在的细胞类型和分子特征。接着便基于这些数据筛选出了具有分子特征和功能相关的150多个基因，并通过MERFISH技术（一种高通量的基因原位检测技术）对这些基因在下丘脑进行了对应一系列的原位检测，既在原位水平鉴定出存在的细胞类型又针对细胞所在的位置构建出一种更实用更精细的空间转录组图谱。
后续基于这些信息，本文又将特定细胞类型与特定行为关联进行功能分析，从而实现从分子到位置到功能的关联分析与探索。
正是这种不同维度技术的结合，可以使我们精准的、量化的、精细的观察细胞类型，位置以及功能。它绘制的是细胞图谱，也是空间图谱，更是功能图谱。所谓既见树木，又见森林。
随着技术的发展以及研究的深入，单一的技术已经不能满足日益增长的研究需求了，往往需要不同层次的技术联合使用，以取得更加全面更加精确的信息。以上只小谈了一下单细胞测序技术结合基因原位检测的部分作用和意义，还有很多的方面可进行应用和扩展，技术的开发与研究的需求总是相辅相成，互相促进的。
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现在单细胞测序技术已经十分成熟，而且门派林立，各有千秋，甚至要共聚江湖，一决高下。而在单细胞单分子级别的基因原位检测领域，还没有形成与之对应的局面，但江湖已成，风雨将行；瞬息万变，且行且看。